軟骨細胞培養指南
20世(shi)紀60年代起人們對軟骨組(zu)織的研(yan)究進(jin)入到細胞(bao)水平。
1967 年(nian) ManningWK 等使用胰蛋白酶聯合細菌膠原酶消(xiao)化分離與培養人軟骨細胞(bao)獲(huo)得(de)成功(gong)。
目前人軟骨細(xi)胞體外分(fen)離與(yu)培養的方法已被廣(guang)泛應用于軟骨細(xi)胞生(sheng)物學(xue)研究，為骸骨軟化癥、骨關(guan)節炎( osteoarthritis ， OA )等(deng)(deng)疾病的防治及(ji)組織工程技(ji)術修復軟骨缺損(sun)等(deng)(deng)研究提供了重要的方法學(xue)參考。
人軟骨細胞特點
幼稚的軟骨細胞(bao)位于(yu)軟骨(gu)組織(zhi)的表層，單個分布，體積(ji)較小，呈(cheng)橢(tuo)圓(yuan)形，長(chang)軸與(yu)軟骨(gu)表面(mian)平(ping)行，越(yue)向深層的軟骨(gu)細胞體積(ji)之間增大呈(cheng)圓(yuan)形，細胞核圓(yuan)形或(huo)卵圓(yuan)形，染(ran)色淺，細胞質(zhi)弱(ruo)嗜(shi)堿性，常見數(shu)量不一(yi)的脂滴。
成熟的軟(ruan)骨細胞多2~8個(ge)成群分布于軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)陷(xian)窩(wo)內(nei)(nei)，這些軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)由同(tong)一(yi)個(ge)母細(xi)胞(bao)分裂增殖而(er)成，稱為同(tong)源(yuan)細(xi)胞(bao)群。電鏡下(xia)，軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)有(you)突(tu)起(qi)和(he)(he)皺褶，細(xi)胞(bao)質(zhi)內(nei)(nei)有(you)大(da)量的(de)(de)(de)粗(cu)面內(nei)(nei)質(zhi)網和(he)(he)發達的(de)(de)(de)高爾(er)基復合體及少(shao)量的(de)(de)(de)線粒(li)體。在組織切片中(zhong)，軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)收縮為不規則形，在軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)囊和(he)(he)細(xi)胞(bao)之間出現較大(da)的(de)(de)(de)腔(qiang)隙。
軟骨細胞培養及傳(chuan)代
圖A為原代細胞分離培養軟骨細胞貼壁后的形態，細胞(bao)呈多角型，扁平(ping)狀，胞(bao)質豐富，可(ke)見清晰、圓(yuan)形的細(xi)胞核(he)，部分區(qu)軟骨細(xi)胞集落樣生長(chang)。
圖B為軟骨細胞傳代培養后的形態，細胞(bao)似橢圓形，細胞(bao)胞(bao)漿豐富。
隨(sui)傳(chuan)代次(ci)數(shu)不斷增加，軟骨細(xi)胞集(ji)落中的(de)梭形細(xi)胞數(shu)目逐漸增多(duo)。
為(wei)什(shen)么一傳代就變形？
在體外培養人軟骨細胞時，隨著傳代次數增加軟(ruan)骨標(biao)志性蛋白Ⅱ膠原合成分(fen)泌減(jian)少，而Ⅰ、Ⅲ型膠原合成分(fen)泌增多。
Ⅱ膠原的(de)(de)合(he)成和分泌(mi)是維持軟骨(gu)細(xi)胞分化表型的(de)(de)特征性指標，提供了軟骨(gu)特有(you)的(de)(de)張力(li)和硬(ying)度。
軟(ruan)骨(gu)中的(de)(de)其他分子與膠(jiao)原蛋白結合形成網(wang)狀(zhuang)結構，支持(chi)軟(ruan)骨(gu)具有一定的(de)(de)彈性，對(dui)于(yu)軟(ruan)骨(gu)維持(chi)形狀(zhuang)及承載外(wai)來負荷起著非常重要(yao)的(de)(de)作(zuo)用。
所以，隨著傳代次數的增加，維持細胞(bao)形(xing)態的物質會(hui)逐(zhu)漸減少(shao)，細胞(bao)的形(xing)態就會(hui)發生改變(bian)。
這種形態和功能的變化稱之為反(fan)分化現象，也(ye)是單層(ceng)傳代(dai)細(xi)胞(bao)的普(pu)遍現象。
軟骨細胞(bao)傳代方法
1. 低密度培養的軟骨細胞易發生去分化現象，一般最適接種(zhong)密度為2~10×10^4/cm2;
2. 軟骨細胞代謝較為緩慢，無(wu)需增(zeng)加換液頻度，可能破(po)壞(huai)由(you)細胞分泌而形成的群體化學環(huan)境。
傳(chuan)代步驟(zou)
如果細胞密度(du)達80%-90%，即(ji)可進行傳代培養。
1. 棄去培養上(shang)清，用(yong)不含鈣、鎂離子(zi)的(de)PBS潤洗細胞(bao)1-2次。
2. 加2ml消(xiao)(xiao)(xiao)化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于(yu)培養(yang)(yang)瓶中，置于(yu)37℃培養(yang)(yang)箱中消(xiao)(xiao)(xiao)化1-2分鐘，然后在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下觀(guan)察(cha)細(xi)胞消(xiao)(xiao)(xiao)化情(qing)況，若細(xi)胞大部(bu)分變圓并脫落(luo)，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yang)(yang)瓶后加少(shao)量培養(yang)(yang)基(ji)終止消(xiao)(xiao)(xiao)化。
3. 按6-8ml/瓶補加培(pei)養基，輕輕打(da)勻后(hou)(hou)吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培(pei)養液后(hou)(hou)吹(chui)勻。
4. 將細胞懸液按1：2到(dao)1：5的(de)比例分(fen)到(dao)新(xin)(xin)的(de)含8ml培養基的(de)新(xin)(xin)皿(min)中或者瓶中。
